前面講到利用流式細胞術進行細胞凋亡檢測的annexinV/PI雙染色法，今天主要簡要介紹SYTO/PI雙染色法、細胞DNA含量分析法、TUNEL法。

SYTO/PI雙染色法

SYTO系列染料是一種

細胞膜通透性的核酸染料

，可以

自由進入活細胞與細胞內的DNA或者RNA結合，未結合時發射熒光訊號的能力很弱，與核酸結合後發射熒光訊號的能力大幅度升高

。根據SYTO發射熒光訊號波長的不同，主要可以分為

藍、綠、橙和紅四大類

。用SYTO染料標記細胞後，尤其是與PI染料共同標記時可以區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，因此其最主要的應用就是檢測細胞凋亡，其中最具有代表性的是SYTO11、SYTO16、SYTO17和SYTO62等。

SYTO與活細胞的核酸結合得最多，所以用SYTO標記細胞時，

活細胞SYTO發射的熒光訊號最強

，

SYTO與凋亡細胞核酸結合的能力大幅度減弱，與壞死細胞核酸結合的能力最低

，所以SYTO染料可以用於鑑別活細胞、凋亡細胞和壞死細胞。SYTO染料結合凋亡細胞核酸的能力減弱的確切機制目前尚未明確，

可能與細胞凋亡時染色質固縮導致SYTO結合位點減少以及RNA降解

等有關。

SYTO/PI雙染色法檢測細胞凋亡的方法非常簡單，只需將SYTO染料和PI染料直接加入待測的單細胞懸液中，SYTO染料的標記終濃度為50nmol/L，PI染料的標記終濃度為5ug／ml，避光常溫靜置20min即可。

SYTO11和SYTO16由488nm鐳射激發，FL1通道接收熒光訊號；SYTO17和SYTO62由633nm鐳射激發，APC通道（通常是FL4）接收熒光訊號

。

下圖所示的是用SYTO/PI雙染色法檢測細胞凋亡的流式圖。活細胞、凋亡細胞和壞死細胞結合SYTO的能力依次遞減，PI是細胞膜非通透性染料，活細胞和凋亡細胞的細胞膜是完整的，不能被PI染料標記，而壞死細胞的細胞膜已經不完整，可以被PI染料標記。所以用SYTO/PI雙染色時，活細胞表現為SYTOhighPI-，如圖中右側細胞群所示；凋亡細胞表現為SYTOdimPI-（中間細胞群）；壞死細胞表現為SYTOlowPI+（左側細胞群）。

細胞DNA含量分析法檢測細胞凋亡

用PI染色法檢測細胞內DNA含量也可以用於檢測細胞凋亡。細胞凋亡時核酸內切酶被啟用，細胞內的DNA廣泛斷裂，一方面在標記PI時必須先用固定劑固定細胞使細胞膜的通透性增加，讓PI染料能夠透過細胞膜進入細胞內部與DNA結合，此時凋亡細胞內斷裂的DNA小碎片就可以透過細胞膜逸出細胞；另一方面凋亡細胞內的DNA小碎片也會降解。所以，

凋亡細胞內的DNA含量比正常細胞少，在PI通道上檢測到的熒光訊號就會比正常二倍體DNA含量的熒光訊號弱

。所以凋亡細胞會在DNA直方圖二倍體峰的前面出現一個DNA含量少於二倍體的亞二倍體峰（凋亡細胞峰），如下圖所示。PI染色法檢測細胞內DNA含量的方法後邊還會有詳細介紹。

雖然此法比較簡單，也較為常用，但是

這種方法的特異性並不是很高

。因為亞二倍體峰的出現並不是凋亡細胞所特有的，非整倍體細胞、機械損傷的細胞也可以出現這種亞二倍體峰。所以用此方法檢測細胞凋亡時，

應先用其他方能確定樣品細胞內的確有凋亡細胞

，而沒有其他引起亞二倍體峰出現的情況，再用此方法定量檢測樣品內凋亡細胞的比例。

TUNEL法

TdT介導的

dUTP缺口末端標記法

（TdTmediated-dUTP nick end labelling， TUNEL）是20世紀90年代發展起來的檢測細胞凋亡的方法，可用於

石蠟包埋組織切片和冰涼組織切片的免疫組織化學分析和單細胞懸液的流式細胞術分析

。細胞凋亡時，

核酸內切酶被活化，細胞內雙鏈DNA上會出現很多不對稱的斷裂點，此時加入脫氧核苷酸末端轉移酶（terminaldeoxynucleotidyl transferase, TdT）和熒光素偶聯的dUTP,TdT可以催化熒光素偶聯的dUTP連線到凋亡細胞DNA上的這些斷裂點，而熒光素偶聯的dUTP不能連線到活細胞內完整的DNA，流式分析就可以區別凋亡細胞和正常活細胞

。TUNEL法檢測細胞凋亡時需要將外源性的熒光素偶聯的dUTP和TdT匯入細胞內，而凋亡細胞和活細胞的細胞膜都是完整的，所以

標記時首先要用固定劑固定細胞，然後用打孔劑在細胞上打孔，讓熒光素偶聯的dUTP和TdT進入細胞內才能完成標記過程

。

TUNEL法不僅能夠識別凋亡細胞中由核酸內切酶催化產生的DNA斷點，而且

能夠識別有絲分裂DNA複製時產生的組成性生理性切口和組蛋白轉錄後修飾點，以及壞死細胞的隨機DNA斷點

。因此，TUNEL告檢測細胞凋亡的

特異性並不高

，無法區分凋亡細胞、有絲分裂的細胞和壞死細胞