使用者1535580514614362019-11-14 19:38:44

楊樹菇和大多數木生型菇菌一樣，其純菌種可用孢子分離法、組織分離法或菇木分離法獲得。通常以交叉使用前兩種分離方法為主。前面已經說過，我國楊樹菇的單孢子菌株具有結實能力，因此在進行孢子分離時，可採用單孢分離法獲得純菌種，經過出菇鑑定後，挑選優良菌株作母種使用。或在生產上使用的優良菌株中，選取生長健壯、形態正常、無病蟲害的幼嫩子實體作為分離材料，按照組織分離的無菌操作程式分離接種。以下簡要介紹單孢分離法和出菇鑑定要求。1。單孢分離法（1）單孢稀釋分離法 將選擇好的種菇置於孢子彈射分離裝置內進行孢子彈射，收集孢子（彈射分離方法見黃傘有關部分）。然後對收集的孢子用無菌水進行稀釋分離。將稀釋後的孢子懸浮液滴在載玻片上，放在低倍鏡下進行檢查，至每滴中有4～5個孢子為合適。接種時，用注射器吸取孢子懸浮液，將試管棉塞拔松，沿試管壁插入注射器針頭，每支試管注入1～2滴孢子懸浮液，轉動試管，使孢子均勻地分佈在培養基表面，靜置1～2小時後，移入溫箱培養。也可將已稀釋的孢子懸浮液注入培養皿內，每個培養皿加1～2滴即可，然後倒入已溶化並冷卻到45℃的瓊脂培養基，厚0。5釐米，在工作臺上左右旋轉混勻，靜置1～2小時，倒轉培養。孢子萌發後，將單孢菌落連同少許培養基移接到試管內培養。（2）單孢定位切割分離法 浙江省農業科學院園藝研究所範雷法等（1996）曾介紹一種自制簡易定位切割器，能快速、準確的分離單孢菌落。定位切割器製作方法如下：選用普通圓珠筆芯塑膠空管一小段，長2～3釐米，用刀片將空管一端削成薄片，另一端用火熔化壓成平頭，用一隻乳膠指套，在其中間打一孔，插上上述做好的塑膠平頭，將其固定在40或100倍顯微鏡的鏡頭上，使其緊密接觸。切割器的尖頭部分，要削得薄、長而光滑，使之能切割完好，為粘連切割圈外的培養基；切割器與物鏡固定要緊，且位置在正中，使物鏡與筆芯空管處於同一軸心上。做成之後用以下方法進行校正：在載玻片或培養皿上倒入一薄層（厚2～3毫米）水樣瓊脂培養基，凝固後，用帶有定位器的物鏡鏡頭，輕輕轉動上下調節器，使定位切割器下降，並切割到培養基的2/3處，勿切割到底，以免損壞定位器和瓊脂培養基的表面；再轉動調節器，使定位切割器上升，用低倍鏡觀察定位切割器切割後的培養基塊是否在視野正中，如果不在正中，則應對乳膠指套的相對位置進行調節，至適合要求。如顯微鏡是以載物臺作為上下調節的，也可用同樣方法校正。一般普通筆芯內徑在2毫米左右，約是低倍鏡的2倍左右視野。定位切割器使用前浸泡在酒精內消毒備用。按常規方法將孢子稀釋後製成PDA瓊脂平板，在低倍鏡下檢查，若確認為單孢，則可改用定位切割器進行切割，按上述方法在同一培養皿內將單孢切割完畢。再將金屬針打扁，使尖端平而稍彎曲，用來在培養皿內挑取切割塊，要儘量避免碰到圈外培養基，然後移置在斜面上培養。（3）試管稀釋點樣法 用滅菌接種針在培養皿內蘸取少量擔孢子，或用接種針直接從菌褶上輕輕刮取少量孢子，洗入試管內的無菌水中，充分搖動，使之均勻分散。然後用滅菌接種針蘸取1滴孢子液，放在載玻片上，用低倍鏡檢查，如果每滴水中仍有3～4個孢子，應繼續稀釋，至每滴中含1～2個孢子為止。將水滴滴在培養皿蓋的邊緣2釐米處，再用低倍鏡檢查，將只有1個擔孢子的水滴用蠟筆在反面作標記，並加1滴營養液。為防止培養液過快蒸發，在培養皿內加少許無菌水，用紙包好進行培養。第二天，孢子萌發，經鏡檢，確認為只有1個芽管，可以在水滴上加一小片瓊脂塊，以便孢子萌發後繼續生長。2～4天后，將菌絲連同瓊脂塊移到試管內培養。（4）毛細管切割法 將不同稀釋度的孢子懸浮液滴入培養皿的瓊脂平板上，每個培養皿放1～1。5毫升，停留幾分鐘後，倒去多餘的水，進行保溫培養。孢子發芽後，在低倍鏡下用毛細管割取只有1個芽管的單孢子，移接到瓊脂斜面上培養。2。多孢分離法 按常規方法準備好瓊脂平板培養基，用滅菌紗布或濾紙吸去皿蓋反面的冷凝水。從楊樹菇子實體上剪下一小塊菌蓋，菌蓋下約有6～7片菌褶，再將菌褶的前端和基部剪去，留下的菌褶長約1。5～2釐米，再蓋到培養皿上，放到溫室培養。6小時後，將培養皿蓋按順時針方向移動若干度（不得小於30度），以後每隔3～4小時按同樣方向移動若干度，最後回覆到原來位置。然後，移去分離材料，將培養皿放在適溫下培養，在平板上會出現不同密度的菌落，挑選分散性較好，且又連線成片的菌落，轉入試管內培養。用這種方法，能及時發現混入傘菌孢子內的雜菌。或將一小片菌褶貼附在試管壁上，使孢子直接散落在斜面上。3。組織分離法 選取肉厚、朵大、無病蟲害、六七分成熟的子實體作種菇用，已開始彈射孢子的不可作種菇。將選好的種菇用自來水沖洗數次，再用無菌水沖洗數次，然後用無菌紗布或濾紙吸乾水分。在接種箱內按無菌操作方法進行組織分離。用手將種菇蓋邊輕輕撕開，手指不要接觸撕開後露出的菌肉部門。將解剖刀在火焰上燒灼滅菌，待冷卻後，在菌蓋和菌柄或菌蓋與幼嫩菌褶連線處挖取一小塊（約綠豆粒大小），接種在斜面上。在切取組織塊時，不要挖取接近菌蓋邊緣的部分，以減少雜菌汙染。接種時，將組織塊準確地接種在斜面的中央，切勿在斜面上到處移動，這樣便於及時鑑別組織塊是否有細菌汙染，或當汙染出現後便於進行純化分離。接種後，將斜面置於23～25℃下培養，若組織塊上有白色菌絲萌發，並向培養基上蔓延，1～2天后，及時用接種針挑取少量帶有菌絲的培養基，接種到空白斜面上進行純化培養，即可獲得楊樹菇母種。組織分離時，組織塊附近若出現黴菌汙染，因黴菌絲與楊樹菇菌絲生長速度相近或更快，故予淘汰。如果組織塊附近出現灰白色或黃白色黏狀物或水漬樣物，則是細菌、酵母菌汙染的表現。這時可降低培養溫度，抑制汙染菌落的生長，當楊樹菇菌絲的菌落長到細菌（酵母）菌落之外時，則可採用切割菌落前端的方法進行純化，也可得到楊樹菇的純培養物。當菌絲長滿斜面時，檢查培養基的背面，若在楊樹菇菌絲的下面出現黃褐色的斑塊，則是被菌絲覆蓋的細菌（酵母）菌落，可用切割菌絲生長前端的方法再次進行純化培養，有時這種純化分離要連續進行多次才能獲得純菌種。這種方法只是一種輔助措施，只有當組織分離的絕大部分斜面都被汙染時，才可以採用這種純化分離法獲得母種。4。出菇鑑定 為了檢驗所分離單孢子菌株是否具有結實能力，出菇特性以及產量水平，對分離物要進行出菇鑑定。此工作可分別在液體培養基和固體培養基上進行。（1）液體出菇 鑑於楊樹菇易於在液體培養基中生長，出菇試驗可採用液體培養。培養液的組成為：玉米粉25克，豆餅粉10克，葡萄糖10克，硫酸鎂1克，磷酸二氧鉀2克，蒸餾水（或自來水）1000毫升。將上述培養液分裝於1000毫升三角瓶中，每瓶裝量200～250毫升，按常規進行高壓滅菌備用。接種後於25℃靜置培養，約15天左右，在培養液表面陸續開始分化原基，並形成正常子實體。在25℃有散射光條件下，絕大多數單孢菌株在15～20天均能分化原始，但出菇時間的早晚與產量沒有正相關性。出菇早雖然是一個良好的生產性狀，但在出菇較晚的菌株中，也可發現出菇密度高，菇潮集中，產量高的優良菌株，這些考核要在固體培養基上進行。採用液體培養進行出菇試驗，不但方法簡單，便於觀察，且便於比較在同一單位時間內，不同菌株間的生物量（將濾取菌絲用水淋洗乾淨，與子實體分別置於60℃烘乾到恆重，用電子天平稱量）。另一特點是在短時間內即可達到出菇試驗的目的。（2）袋式栽培 袋栽培養料組成為：闊葉樹木屑37%，棉籽殼37%，麥麩20%，玉米粉5%，石膏1%，調含水量為65%。每袋裝料300克，於稱量後分裝於塑膠袋中，按常規方法進行高壓或常壓滅菌備用。接種後在25℃培養，待菌絲滿袋後，將菌袋移至供出菇試驗的栽培室內，每個供試菌株一般不得少於20袋，隨機排列在床架上，並在同一環境條件下進行栽培管理。待原基分化後，脫去塑膠袋，隨後進行水分、光照和通風管理。比較其生產性狀和產量。選擇原基分化早，菇叢密，菇數多，單菇粗壯，生物學效率高，抗性好的優良菌株用於生產。 頭條萊垍