以抗PD-1藥物為代表的腫瘤免疫療法快速發展，讓人們看到了戰勝癌症的希望。免疫治療的先驅者陳列平教授提出的“免疫正常化”研究思路，認為腫瘤微環境的複雜性和多樣性與免疫治療療效密切相關。尤其是腫瘤浸潤性淋巴細胞（TILs）的相互協同作用，是抗癌反應的關鍵點。以往免疫微環境研究只能從免疫細胞“整體”表徵下手，而無法突破單個免疫細胞“個體”表徵。現在10x Genomics單細胞V（D）J測序技術在腫瘤免疫微環境中的應用，解決了單個免疫細胞“個體”表徵無法突破的難題，精準的刻畫每個細胞的基因資訊［1］。

10x 單細胞V(D)J測序的前世今生

2009年單細胞測序技術的橫空問世完美的刻畫了每個細胞獨特的微妙變化，揭示全新的細胞型別；到2015年10x Genomics單細胞測序技術的出現，徹底降低了單細胞測序的成本；尤其是2018年10x Genomics單細胞V（D）J測序技術的上市，為腫瘤免疫治療的研究打開了全新紀元。相應成果也備受CNS青睞，文章如雨後春筍般頻頻出現在高分雜誌中，據統計近兩年的重量級高分文章發表篇數60+，平均影響因子達到20（IF：20）。

10x 單細胞V(D)J測序技術大顯身手

小貝已給大家講述了10x單細胞V（D）J測序技術的由來，那麼該技術究竟可以解決那些問題呢？ 想來是大家特別關注的問題~

a

腫瘤微環境與免疫治療

b

自身免疫性疾病的治療

c

器官、骨髓移植的治療

d

抗體開發的噠噠噠噠噠

e

感染性疾病噠噠噠噠噠

10x 單細胞V(D)J測序技術在腫瘤微環境中的用武之地

10x單細胞V（D）J測序技術可以為腫瘤微環境的研究提供哪些的資訊呢？小貝將逐一為大家解析。

1 免疫細胞圖譜構建

透過5’表達和V（D）J資料進行聯合分析，基於基因表達分群的基礎上，可分析克隆資訊鑑別新的細胞亞群。2018年cell發表的肺癌浸潤性免疫細胞研究中，透過t-SNE降維、聚類分析，將來源於癌、癌旁和外周血中的9，055個T細胞分為7個CD8+T細胞亞群和9個CD4+T細胞亞群。並按照相關的marker基因，將這些cluster進行註釋，精準刻畫了肺癌T細胞的免疫圖譜。

圖1。 T細胞亞群免疫特徵（圖片引自原文［2］）

2 免疫細胞克隆型及丰度研究

在腫瘤微環境的研究中，對樣本Clonotype分型分析和豐度分析，可以追蹤TCR克隆型和轉錄表型，從而揭示腫瘤識別、克隆擴增和T細胞功能的關聯。2019年Cell發表的一篇黑色素瘤浸潤性免疫細胞研究中，使用MARS-seq進行TCR測序，從6，306個T細胞中恢復TCRβ序列資訊，其中包括3，492個獨特的TCRβ序列，並使用“MetaCell”方法計算克隆丰度。從而進一步分析細胞間克隆型及丰度關係。

圖2。 黑色素瘤T細胞TCR克隆型分析（圖片引自原文［3］）

3 TCR-CDR3特徵研究

在T細胞對腫瘤抗原的識別中，CDR3是TCR測序優先選擇的研究目標區域，TCR-CDR3區的特徵（CDR3區的長度、序列等）研究可直接反映出T細胞多型性和克隆化程度，從而反映T細胞的功能及腫瘤免疫應答狀態。2018年Cell發表的一篇腫瘤免疫微環境研究中，對1，744個T細胞的V（D）J區域富集，86％具有至少一個生產性的全長TCR α或β鏈，大多數T細胞含有獨特的TCR，並且透過TCR-CDR3區域分析，從而證明FT和PDO中表現最高的TCR克隆型在耗盡的T細胞中相同地集中。

圖3。 T細胞TCR-CDR3特徵分析（圖片引自原文［4］）

4 細胞亞群發育軌跡研究

已有的T細胞研究表明，T細胞亞群之間各自獨立成簇，但彼此之間無明顯界限，可能存在一定的連續性，說明不同細胞亞群間可能有潛在的發育關係。因此對Cluster的細胞分群進行擬時序分析，可以構建亞群間的發展軌跡。2018年Cell發表的一篇非小細胞肺癌T細胞圖譜研究中，對不同簇的CD8 +T細胞進行擬時序分析，透過Monocle方法推斷CD8+T細胞分支軌跡，共享的TCRs推斷CD8 + T細胞群的狀態轉移。對CD8+ T細胞進行了擬時序分析，構建了亞群間潛在的發展軌跡，這一結果也透過亞群間TCR克隆分析得到驗證。

圖4。 擬時序分析（圖片引自原文［2］）

5 多樣本TCR差異研究

多樣本TCR研究可將同一患者治療前後或不同患者間的樣本進行免疫組庫資料對比分析，得到樣本間免疫組庫多樣性的差異，可分析疾病發生時及藥物治療前後機體免疫組庫多樣性的變化，有利於進一步解析疾病發生髮展的原因［5］。2019年Nature Medicine發表的一篇基底細胞癌免疫治療前後腫瘤浸潤T細胞的研究，基於TCR-seq資料分析，PD-1治療後出現大量新型的克隆擴增，與所有其他CD8 +T細胞表型相比，耗竭CD8 +T細胞在治療後顯著擴增的克隆比例更高，並且觀察到耗竭CD8 +T細胞克隆的克隆替換。

圖5。 多樣本TCR分析（圖片引自原文［6］）

總 結

10x Genomics單細胞V(D)J測序有三好

超高性價比：

同時測量來自相同單細胞配對的TCR α/β和BCR重鏈/輕鏈資訊和基因表達，精準TCR/BCR結構資訊。

更直觀：

使用直觀的軟體工具展示免疫組庫的克隆性，多樣性和細胞環境，對於分析軟體工具視覺化。

更全面：

分析數百至數萬個淋巴細胞，以檢測罕見的全長V（D）J轉錄本和細胞亞群。

參考文獻

1。 Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment ［J］。Cell， 2018。

2。 Guo X ， Zhang Y ， Zheng L ， et al。 Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing［J］。 Nature medicine， 2018， 24（7）。

3。 Dysfunctional CD8 T Cells Form a Proliferative， Dynamically Regulated Compartment within Human Melanoma ［J］。Cell 2019， 176（4）：775-789。

4。 Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment［J］。Cell， 2018。11。021。

5。 Jiao S ， Subudhi S K ， Aparicio A ， et al。 Differences in Tumor Microenvironment Dictate T Helper Lineage Polarization and Response to Immune Checkpoint Therapy［J］。 Cell， 2019， 179 （5）：1177-1190。e13。

6。 Yost K E ， Satpathy A T ， Wells D K ， et al。 Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade［J］。 Nature medicine， 2019， 25（7735）。

7。 Zhang A W， O‘Flanagan C ， Chavez E A ， et al。 Probabilistic cell-type assignment of single -cell RNA-seq for tumor microenvironment profiling［J］。 Nature Methods， 2019， 16 （10）：1-9。